Barwienie metodą Grama

Różnicujące

Laseczki wąglika zabarwione metodą Grama (Gram +)
Metoda
Zastosowanie	rozróżnianie bakterii pod względem budowy ściany komórkowej
Użyte odczynniki	roztwór fioletu krystalicznego, płyn Lugola, 90% etanol z dodatkiem acetonu, fuksyna karbolowa lub safranina
Metoda	Grama
Zabarwienie wybranych struktur
Multimedia w Wikimedia Commons

Metoda Grama – metoda barwienia bakterii. Pozwala doświadczalnie zróżnicować te organizmy na dwie duże grupy (Gram-dodatnie i Gram-ujemne) ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, co za tym idzie, także pewne różnice w fizjologii i podatności na leki.

Została opracowana w 1884 przez Duńczyka, Hansa Christiana Grama (1853–1938).

Schemat barwienia

• na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę hodowli płynnej lub w przypadku hodowli stałej nanieść 1-2 krople soli fizjologicznej i wykonać rozmaz
• szkiełko z rozmazem pozostawić do całkowitego wyschnięcia, po czym preparat utrwalić (dzięki temu procesowi jest łatwiejsze wnikanie barwnika do wnętrza komórki):
  • fizycznie: trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika;
  • chemicznie: poprzez użycie np.: formaliny lub etanolu z domieszką eteru;
• utrwalony preparat zalewać nad rynienką roztworem fioletu krystalicznego z dodatkiem 1-2% fenolu^[1]
• odczekać 60 sekund do 3 minut^[1]
• tryskawką delikatnie zmyć barwnik
• zalać preparat jodyną lub płynem Lugola
• odczekać 30 sekund do 2 minut^[1]
• ostrożnie odbarwić całość w etanolu przez ok. 10-20 sekund
• spłukać preparat wodą destylowaną
• dobarwić innym barwnikiem, np. safraniną czy fuksyną zasadową przez ok. 30 sekund
• dobrze spłukać preparat wodą destylowaną i po wyschnięciu oglądać pod mikroskopem

Mechanizm barwienia

1. Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym.
2. Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie fioletowe.
3. Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1–2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik. Możliwe też, że kompleks fiolet-jod łączy się trwale z kompleksem rybonukleinianu magnezu (niedobór magnezu może powodować barwienie na czerwono bakterii zasadniczo Gram-dodatnich) i zasadowego białka, które są obecne w ścianie bakterii Gram-dodatnich w dużych ilościach^[1] lub bardziej ujemnie naładowana (inny punkt izoelektryczny) ściana Gram-dodatnich silniej wiąże zasadowy fiolet^[1].
4. Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są fioletowe, zaś Gram-ujemne – bezbarwne.
5. Dodatkowy barwnik (np. safranina lub fuksyna) barwi komórki Gram-ujemne na różowo lub czerwono, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.

Efekt barwienia Grama

W efekcie wyżej przedstawionych działań i opisanego mechanizmu komórki efekty mogą być czworakie:

• bakterie barwiące się na kolor ciemnofioletowy, prawie czarny, określa się jako Gram-dodatnie (Gram +)^[2]
• bakterie odbarwiające się pod wpływem etanolu z koloru ciemnofioletowego na kolor różowy, określa się jako Gram-ujemne (Gram −)^[2]
• bakterie niebarwiące się standardową metodą Grama^[2], np. prątki (są trudnobarwliwe – można je wybarwić poprzez wydłużenie czasu dla fioletu krystalicznego i płynu Lugola),
• bakterie Gram-zmienne^[2], np. Gardnerella vaginalis.

Efekt barwienia zależy od podłoża i wieku hodowli:

• starsze hodowle Clostridium mogą barwić się Gram-ujemnie (normalnie są one Gram-dodatnie)^[1]
• kiełkujące przetrwalniki (i pierwsze pokolenie po wykiełkowaniu) Bacillus subtilis barwią się Gram-ujemnie (normalnie są one Gram-dodatnie)^[1]

Przypisy

Bibliografia

• WładysławW. Kunicki-Goldfinger WładysławW., Życie bakterii, wyd. 7, Warszawa: Wydaw. Naukowe PWN, 1998, s. 42, ISBN 83-01-12786-4, OCLC 749468298 .